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一、高通量測序（NGS）實驗室簡介

1.1NGS實驗室又叫高通量測序檢測實驗室。NGS是下一代測序技術(shù)( Next Generation Sequencing)即高通量測序技術(shù)的簡稱。高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)Sanger測序（稱為一代測序技術(shù)）革命性的改變, 可同時對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能, 也稱為深度測序(Deep sequencing)。

1.2由于NGS技術(shù)對所檢測的核酸模板進行大量擴增，容易出現(xiàn)實驗室污染導致檢測結(jié)果準確性下降；另外NGS技術(shù)要求高、影響因素多，實驗過程處理不當易導致檢測結(jié)果準確性下降或檢測失敗。因此臨床基因擴增檢驗實驗室技術(shù)驗收和規(guī)范化管理是NGS技術(shù)本身需要，也是在臨床上順利應(yīng)用該技術(shù)前提。

二、NGS實驗室臨床應(yīng)用的基本條件

2.1必須擁有符合臨檢中心相關(guān)規(guī)定的標準NGS實驗室。

2.2檢測設(shè)備必須符合標準NGS實驗室設(shè)置要求：高通量測序儀及配套服務(wù)器；高通量測序檢測試劑盒；通用電腦；自動分析軟件，實驗室樣本信息管理系統(tǒng)等。

2.3檢測人員必須通過專門的技能培訓，并獲得省級以上衛(wèi)生計生行政部門頒發(fā)的臨床基因擴增檢驗技術(shù)上崗證書。NGS實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛(wèi)生部的要求，確保檢測結(jié)果準確、確保實驗室衛(wèi)生安全，確保實驗室長期穩(wěn)定運行。

2.4NGS臨床應(yīng)用必須在無菌無塵環(huán)境下進行操作。

三、NGS實驗室建設(shè)基本要求

3.1主體結(jié)構(gòu)

主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽角均采用鋁合金50內(nèi)圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。

3.2標準的各區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)

將檢測過程分成試劑準備、樣本制備、PCR擴增和高通量測序四個獨立的實驗區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個檢測實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。

可打開緩沖區(qū)和PCR 擴增區(qū)的排風扇往外排氣，在實驗區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調(diào)的回風口，空氣通過回風口向室內(nèi)換氣。

3.3消毒

在每個實驗區(qū)和緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在各區(qū)還設(shè)置移動紫外線燈，對實驗桌進行局部消毒。

3.4機械連鎖不銹鋼傳遞窗

試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。

3.5地面

地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。

3.6照明

燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點。

3.7平面布局

NGS實驗室應(yīng)根據(jù)自己的檢驗項目、所采用的檢測技術(shù)平臺和工作量來決定分區(qū)的多少及各區(qū)域的空間大小，至少具體需要多少個區(qū)，同樣是“個體化”的，以“工作有序、互不干擾、防止污染、報告及時”作為基本原則。

四、各項目實驗室建設(shè)標準

產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（全基因組低拷貝測序技術(shù)）

1.實驗室平面圖

圖1：產(chǎn)前篩查與診斷實驗室平面圖

2.  技術(shù)流程圖

圖2：產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)流程圖

3.  技術(shù)參數(shù)

4.分區(qū)功能

4.1試劑準備室

主要功能：在NGS過程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。

4.2標本與文庫制備區(qū)

主要功能：血液處理、血漿制備、DNA提取、DNA片段化、DNA樣品的純化、DNA濃度檢測、末端修復(fù)、接頭連接、構(gòu)建樣本的測序文庫。

4.3文庫擴增與檢測區(qū)

主要功能：文庫構(gòu)建后的PCR擴增與純化、文庫濃度檢測、文庫的混合及混合后的質(zhì)檢分析。

4.4測序區(qū)

主要功能：測序模板制備（乳液PCR與磁珠富集回收）、上機測序、數(shù)據(jù)分析、報告審核及發(fā)放。

5.儀器配置

5.1試劑準備室

主要儀器設(shè)備：加樣器、冰箱、分析天平、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈和超凈工作臺等。

5.2標本與文庫制備區(qū)

主要儀器設(shè)備：冷凍離心機、微量臺式離心機、掌上三管離心機、渦旋震蕩器、垂直混合儀、移液器、可移動紫外燈、生物安全柜、冰箱、托盤天平、Qubit 2.0核酸定量儀、電腦（可連接互聯(lián)網(wǎng)）、條形碼打印機、普通打印機、掃描槍、磁力架等。

5.3文庫擴增與檢測區(qū)

主要儀器設(shè)備：PCR儀、QPCR儀、Qubit2.0核酸定量儀、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、UPS、冰箱、移液器、磁力架等。

5.4測序區(qū)

主要儀器設(shè)備：高通量測序儀、PC電腦、打印機、UPS、恒溫金屬浴、純水儀、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、超凈工作臺、可移動紫外燈、磁力架、PCR儀等。

n胚胎植入前遺傳學診斷（全基因組低拷貝測序）

1.  實驗室平面圖

圖3：PGD實驗室平面圖

2.  技術(shù)流程圖

圖4：PGD技術(shù)流程圖

3.  技術(shù)參數(shù)

4.  分區(qū)功能

4.1試劑準備室

主要功能：在NGS過程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。

4.2WGA制備區(qū)

主要功能：基因組DNA釋放、全基因組DNA擴增。

4.3電泳區(qū)

主要功能：DNA電泳檢測及結(jié)果反饋、DNA打斷等

4.4擴增一區(qū)

主要功能：DNA片段的末端修復(fù)與純化、接頭連接與純化、文庫混合、缺口平移。

4.5文庫檢測區(qū)

主要功能：文庫濃度質(zhì)檢分析。

4.6測序區(qū)

主要功能：測序模板制備（乳液PCR與磁珠富集回收）、上機測序、數(shù)據(jù)分析、報告審核及發(fā)放。

5.儀器配置

5.1試劑準備區(qū)

主要儀器設(shè)備：冰箱、分析天平、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈和超凈工作臺等。

5.2電泳區(qū)

主要儀器設(shè)備：電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈等。

5.3WGA制備區(qū)

主要儀器設(shè)備：PCR儀、超凈工作臺、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈等。

5.4擴增一區(qū)

主要儀器設(shè)備：PCR儀、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、UPS、移液器、磁力架等。

5.5文庫檢測區(qū)

主要儀器設(shè)備：QPCR儀、Qubit2.0核酸定量儀、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、冰箱、移液器等。

5.6測序區(qū)

主要儀器設(shè)備：高通量測序儀、PC電腦、打印機、UPS、恒溫金屬浴、純水儀、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、超凈工作臺、可移動紫外燈、磁力架、PCR儀等。

n遺傳病診斷+腫瘤診斷與治療（雜交捕獲測序技術(shù)+Sanger測序驗證）

1.   實驗室平面圖

圖5：腫瘤診斷實驗室平面圖

2.  技術(shù)流程圖

圖6：腫瘤診斷技術(shù)流程圖

圖7：一代測序?qū)嶒灹鞒虉D

3.  技術(shù)參數(shù)

4.  分區(qū)功能

4.1試劑準備區(qū)

主要功能：在NGS過程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。

4.2標本與文庫制備區(qū)

主要功能：樣本接收、樣本前處理、全基因組DNA提取以及各種樣本DNA或者RNA的提取、DNA片段化、DNA純化、DNA濃度測定、DNA片段的末端修復(fù)與純化、接頭連接與純化。

4.3DNA打斷區(qū)

主要功能：DNA打斷（片段化）。

4.4電泳區(qū)

主要功能：片段化DNA電泳檢測及結(jié)果反饋。

4.5雜交捕獲區(qū)（擴增一區(qū)）

主要功能：目的DNA片段的雜交捕獲與純化，Sanger測序目的片段擴增與純化、Sanger測序PCR前準備。

4.6文庫擴增區(qū)（擴增二區(qū)）

主要功能：雜交捕獲后擴增與純化、文庫濃度質(zhì)檢分析、及Sanger測序的PCR擴增反應(yīng)與純化。

4.7測序區(qū)

主要功能：測序模板制備（乳液PCR與磁珠富集回收）、上機測序、及Sanger測序。

5.儀器配置

5.1試劑準備區(qū)

主要儀器設(shè)備：加樣器、冰箱、分析天平、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈和超凈工作臺等。

5.2標本與文庫制備區(qū)

主要儀器設(shè)備：微量臺式離心機、掌上三管離心機、恒溫金屬浴、移液器、可移動紫外燈、生物安全柜、冰箱、托盤天平、Qubit 2.0核酸定量儀、PCR儀、電腦（可連接互聯(lián)網(wǎng)）、條形碼打印機、普通打印機、掃描槍等。

5.3DNA打斷區(qū)

主要儀器設(shè)備：Covaris S220超聲波打斷儀、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈等。

5.4電泳區(qū)

主要儀器設(shè)備：電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈等。

5.5雜交捕獲區(qū)（擴增一區(qū)）

主要儀器設(shè)備：PCR儀、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器等。

5.6文庫擴增區(qū)（擴增二區(qū)）

主要儀器設(shè)備：PCR儀、Qubit 2.0核酸定量儀、微量臺式離心機、掌上三管離心機、渦旋震蕩器、移液器、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、磁力架等。

5.7測序區(qū)

主要儀器設(shè)備：高通量測序儀、Sanger測序儀、PC電腦、打印機、UPS、恒溫金屬浴、純水儀、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、超凈工作臺、可移動紫外燈、磁力架、PCR儀等。